免疫组织化学(IHC)(石蜡包埋)
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC），是利用抗原与抗体之间的结合具有高度特异性的原理，通过抗原抗体结合及呈色反应，显示组织或细胞中的化学成分，对组织切片或细胞标本中某些化学成分进行定性、定位或者定量研究。
一、脱蜡
在对石蜡切片染色前，须进行脱蜡处理，才能使切片顺利染色。
1. 二甲苯Ⅰ 10min；
2. 二甲苯Ⅱ 10min；
3. 二甲苯Ⅲ 10min；
4. 无水乙醇Ⅰ 3min；
5. 无水乙醇Ⅱ 3min；
6. 95%酒精 3min；
7. 流水冲洗 3min。
注：试剂须定期更换，脱蜡二甲苯、酒精通常两周更换一次，或根据脱蜡片数确定更换频率。
二、抗原修复
抗原修复方式常用的有高压修复、水煮修复、酶修复；常用的修复溶液有柠檬酸溶液（pH 6.0）、EDTA溶液（pH 9.0）、Tris-EDTA（pH 9.0）、胰酶、胃蛋白酶等。
1. 水煮修复：将加入约1L 1×Tris-EDTA（pH9.0）/ 柠檬酸（PH6.0）缓冲液（根据切片数量调整）倒入高温容器内，用电磁炉加热使其沸腾3-5min确保低火下无气泡；将组织切片放入容器内，电磁炉调至低功率维持温度在90-95℃煮20min，盖上锅盖。室温冷却10min后，流水冲洗冷却至室温。
2. 高压修复：将高压锅中加入1L 1×柠檬酸（pH6.0）缓冲液（根据切片数量调整），不盖紧状态下加热至沸腾，将组织切片放入高压锅内，加阀，加热至均匀喷气后，维持两分钟，室温冷却10min后，待压力阀落下打开高压锅盖，流水冲洗冷却至室温。
注：本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
3. 酶修复：切片稍甩干后用滤纸将组织周围的水擦干，用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走，注意组化笔尖不能沾水，画的圈要大小适中，距离组织0.5cm左右），在圈内滴加胰酶工作液覆盖组织，切片平放于湿盒内室温孵育20min，蒸馏水浸洗3次，每次3 min。
注：抗原修复的原因：在甲醛或多聚甲醛固定过程中，组织中部分抗原发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原活性。通过抗原修复，可以使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测成功率。
三、免疫组织化学染色
1. 用纯水清洗切片三次，每次 5 分钟。
2. 阻断：切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
注：阻断原因：组织中的粒细胞、单核细胞及红细胞等存在内源性过氧化物酶，这些酶和辣根过氧化物酶一样，可与显色剂DAB、AEC起反应而造成假阳性，消除内源性过氧化物酶的方法是用过氧化氢溶液阻断。
3. 用纯水清洗切片两次，每次 5 分钟。
4. 切片稍甩干后用滤纸将组织切片周围的水擦干，用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加1%BSA配制的10%阴性山羊血清，覆盖组织，室温封闭 1 小时。
5. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的一抗（通常100μl/组织），置于湿盒室温孵育1小时。
6. 清除抗体溶液，用1×TBST浸洗3次，每次5分钟。
7. 切片拍干后在圈内滴加羊抗兔或鼠二抗（HA1119或HA1120）覆盖组织，置于湿盒室温孵育20分钟。
*HA1119（HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）【可加链接跳转到商品页面】
*HA1120（HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG UltraPolymer Goat Polyclonal Antibody）【可加链接跳转到商品页面】
8. 用1×TBST浸洗3次，每次 5 分钟。
9. DAB显色：切片拍干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，观察至出现阳性信号或显色5min，用盛有自来水的洗瓶或DAB专用烧杯冲洗玻片终止显色，用自来水流水冲洗5-10分钟。
注：DAB试剂有潜在致突变作用，配制及显色时需戴双层手套防护，DAB显色后使用专用洗涤烧杯，不与其他烧杯混用。
四、复染脱水
1. 苏木素 10min；
2. 流水冲洗 3min；
3. 促蓝 1min；
4. 流水冲洗 3min；
5. 95%酒精Ⅰ 1min；
6. 95%酒精Ⅱ 1min；
7. 95%酒精Ⅲ 1min；
8. 无水乙醇Ⅰ 1min；
9. 无水乙醇Ⅱ 1min；
10. 二甲苯Ⅰ 1min；
11. 二甲苯Ⅱ 1min；
12. 烤箱65℃ 2min。
*试剂须定期更换，促蓝液变色可提前更换。
五、封片
中性树胶封固。
注：整个操作过程应保持切片处在湿润环境中，避免切片变干，否则极易产生非特异染色。