染色质免疫沉淀ChIP
染色质免疫沉淀ChIP
染色质免疫沉淀（ChIP）是一种研究蛋白质与染色质DNA相互作用的技术，根据不同目的既可用于鉴定互作蛋白，也可用于鉴定互作DNA。通常被用于表观遗传学研究，如通过ChIP检测转录调节相关的组蛋白修饰。
一、样品准备
为了获得最佳 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约4 x106个细胞（加上阳性和阴性对照，至少需要 12x106个细胞）。
1. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向15 cm培养皿中添加 540 µl 37% 甲醛（20mL培养基）。 对于悬浮细胞，向悬浮在20 mL培养基中的细胞添加 540 µl 37% 甲醛（为了实现悬浮细胞的最佳固定，固定时细胞密度应小于0.5 x 106个细胞/ml）。 轻轻混匀后，室温下摇床孵育10分钟。甲醛最终浓度为1%。添加甲醛后会看到培养基的颜色变化。
2. 加入2 ml 10x甘氨酸（至终浓度0.125 M），终止反应，室温孵育5分钟。添加甘氨酸会导致培养基颜色变化。
3. 对于贴壁细胞，弃去培养基并加入冰预冷1x PBS洗涤细胞两次，每次从培养皿中完全去除洗涤液。加入5 mL冰预冷1x PBS（含蛋白酶抑制剂混合物），用细胞刮刀将细胞刮下，然后转移至15 mL管中。4°C，1000g离心5分钟，弃去上清。
4. 对于悬浮细胞，将细胞转移至50 mL离心管中，4°C，500 g离心5分钟，并用冰预冷1x PBS洗涤沉淀两次，弃去上清。
5. 加入ChIP裂解缓冲液（每1x107个细胞加入1mL）中，并在冰上孵育 10 分钟。 或者，样品可暂时保存在-80°C，长达3个月。
二、染色质超声破碎
1. 超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。这步需要优化，不同的细胞系需要不同的超声处理时间。
注：
1) 针对接触式探头新芝超声仪的摸索条件：2mm直径微探头，振幅20%（功率为130W），超5s，停15s，设置超声时间梯度2，4，8，12，16min。如HeLa细胞时间2min就可得到较好的染色质片段化样品。
2) 不同的细胞超声条件可能会不一样，需做预实验，需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。不要使探头接触超声管底部或管壁，如超声过程产生泡沫，需暂停超声并调整超声管位置。
3) 超声用的buffer，SDS浓度越高，DNA越容易被打断；盐离子或去垢剂浓度越高，DNA越容易被打断；细胞密度越大，DNA越不容易被打断；相对于常用的肿瘤细胞系，很多原代细胞及组织细胞的染色质超声破碎会更困难些，如T细胞往往很难进行超声检测，因为它们是非常小、紧密的细胞，这个时候需要不同的溶解和超声条件才能实现最好的结果，可将交联反应时间降至5min。
2. 4°C，8,000 g 离心10分钟沉淀细胞碎片，将上清转移至新EP管中。
三、DNA浓度和片段大小的测定
1. 将8 µL 5 M NaCl 添加到200 µL染色质中，并在65°C下振动孵育过夜。
2. 添加1 µL 蛋白酶K (20 mg/mL)，42°C下振荡孵育1小时。
3. 使用 PCR 纯化试剂盒纯化DNA。
4. 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定DNA片段大小。
四、免疫沉淀
1. 样品超声处理条件优化后，对样品进行超声处理。
2. 配制适量含蛋白酶抑制剂的ChIP Dilution Buffer(蛋白酶抑制剂：ChIP Dilution Buffer=1：100)。取100µl超声处理的样品，加入900µl含蛋白酶抑制剂的ChIP Dilution Buffer，使最终体积为1mL。
3. 取出20µL (2%)样品作为Input并在-20℃存储，用于后续检测。同时设置阳性对照以及同型对照（阴性对照）。
4. 样品中加入2-5µg一抗，4℃缓慢转动过夜或至少4小时以上。
5. 再加入40µL Protein A/G Magnetic Beads/Salmon Sperm DNA，4℃缓慢转动60分钟，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。
注：可以直接使用Protein A/G磁珠，对于非特异性结合高度敏感的应用，可以向ChIP反应中添加封闭试剂。封闭试剂：2.5 µg/µL BSA，2.5µg/µL鲑鱼精子DNA（终浓度）。
6. 置于磁力架上分离1分钟，去除上清，切勿触及磁珠。依次使用如下溶液对磁珠进行洗涤，每次洗涤液的用量为1mL，每次4℃缓慢转动或摆动洗涤3-5min，随后置于磁力架上分离1分钟，小心去除上清，切勿触及磁珠。
1) Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
2) High Salt Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
3) LiCl Immune Complex Wash Buffer洗涤一次。
4) TE Buffer洗涤两次。
五、洗脱并解交联
1. 新鲜配制适量Elution buffer (1% SDS，0.1M NaHCO3)。
2. 完成所有洗涤步骤后，加入150µL Elution buffer。
3. 将样品置于带有振荡功能的金属浴中，65℃孵育30min（振幅300 rpm），将染色质从磁珠上洗脱下来。
4. 10,000g离心10秒收集离心管盖子上的残留样品。
5. 将离心管置于磁力架上分离60秒，将上清转移到一新的离心管中，并分别标记。
6. 所有管中，包括input管（取150µL Elution buffer加入到每组对应的input样品中），都加入6µL 5M NaCl和2µL 蛋白酶K（20mg/mL），65℃加热2小时或过夜，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。
六、DNA纯化和分析
1. 150µL样品，按照DNA纯化试剂盒进行操作。
2. PCR检测及分析。