酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫吸附试验(ELISA)
酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是目前应用最广泛的免疫学检测技术，是将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。一般用酶标测定仪测定吸光度（OD 值）来反映抗原或抗体含量，灵敏度可达每毫升纳克（ng）水平甚至皮克（pg）水平。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
目前常用的 ELISA 方法有直接法、间接法、双抗夹心法、竞争法 ELISA。
一、相关试剂配方
2. 封闭液：1x TBST+5%脱脂奶粉或1%BSA3. TMB显色液
二、操作流程
ELISA实验开始前，各试剂均应平衡至室温。试剂或样品稀释时，确保混匀，同时尽量避免起泡。
1. 抗体包被：根据实验需要用碳酸盐缓冲液（CBS）或者磷酸盐缓冲液（PBS）将包被抗体稀释到一定的稀释度，100 μL/孔包被，37℃ 2 h或者4℃过夜。
2. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
3. 封闭：每孔加入200 ~350μL封闭液，37℃，1 h。
4. 洗板：同步骤2。（备注：商品化试剂盒一般已经预包被了包被抗体在酶标板上，不需要进行1-4步骤，使用前请注意核实）。
5. 加样：分别设零孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100 μL，余孔分别加标准品或待测样品100 μL。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应60-120 min。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
注：加样过程中不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，一块板要在10 min内上完样品
6. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
7. 加检测抗体：根据实验需要，将检测抗体用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，45 min。
8. 洗板：同步骤6。
9. 加二抗：根据实验需要，将二抗用1xPBS稀释到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，30 min。
10. 洗板：同步骤6。
11. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
12. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
13. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。
14. 结果判断：
1) 每个标准品和样本的OD值须减去零孔的OD值，如设置复孔，则应取其平均值；
2) 以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用专业制作曲线软件进行四参数拟合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根据样品的OD值由标准曲线推算出相应的拟合浓度，再乘以稀释倍数即为样本的测定浓度。
1. 抗原包板：将包被缓冲液稀释的抗原以100 μL/孔加入酶标板中，37℃ 2 h或者4℃过夜。
2. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
3. 封闭：每孔加入200 μL封闭液，37℃，1 h。
4. 洗板：同步骤2。
5. 加一抗：根据实验需要，用1xPBS稀释一抗到一定的稀释度，100 μL/孔，37℃，45 min。
6. 洗板：同步骤2。
7. 加二抗：稀释的HRP标记二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min。
8. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
9. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
10. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
11. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。
1. 包被：根据实验将包被抗原稀释到一定的稀释度，100 μL/孔包被，37℃ 2 h或者4℃过夜。
1. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板2次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
2. 封闭：每孔加入200 μL封闭液，37℃，1 h。
3. 洗板：同步骤2。
4. 加一抗：根据实验需要，将样品稀释不同的梯度（样品可以是血清、细胞上清、尿液等），并在样品中加入特定终浓度的竞争剂，100 μL/孔，37℃，45 min。
5. 洗板：同步骤2。
6. 加二抗：稀释的HRP标记二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min。
7. 洗板：弃孔内液体，甩干，1xTBST洗板4次，每次浸泡1-2 min，350 μL/孔，甩干（也可以轻拍将孔内液体拍干）。
8. 显色：TMB显色液A液和B液按1:1充分混合，100 μL/孔，37℃孵育10 min。
9. 终止：1M硫酸溶液100 μL/孔，终止显色。
10. 酶标仪读值：以630 nm为校正波长，用酶标仪在450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值），在加终止液后5 min内进行读数。