免疫组织化学（冰冻切片，IHC-Fr）
一、组织准备
1. 新鲜组织取出后置于4%PFA中固定过夜。
2. 1xPBS清洗3次，每次5分钟。
3. 30%蔗糖浸润脱水16-48小时。
4. 提前准备好标记的模具，将组织放入其中，加入OCT包埋。
5. 缓慢将组织模具放入液氮中浸润，之后转移至-80℃冰箱保存。
注：为了快速处理临床样本，直接用OCT冷冻包埋组织，然后切片（6-8μm厚度），这样可以节省时间减少因固定带来的切片难度。
二、切片制作
1. 切片前，从超低温冰箱中取出组织样品，在-20°C的温度下均衡约15分钟，防止切片在封闭时破裂。
2. 将组织切成厚度在5–15µm之间的切片，置于带正电荷的载玻片上。
3. 将切片放置在工作台上风干几分钟（这样可以增加切片的粘附作用）。
注：切好的切片可以置于-80℃保存，保质期1年。
三、染色
1. 切片从冰箱取出后室温恢复15分钟后，用1×TBST浸洗3次，每次3 min。
2. 透膜与封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加封闭液（1xTBST配制的含10%阴性山羊血清，0.3M甘氨酸和0.2%的Triton X-100）覆盖组织，置于湿盒内室温孵育30~60分钟。
3. 清除封闭液，然后每个切片加入用推荐的抗体稀释剂稀释的一抗（通常100μl/组织），置于湿盒4℃孵育过夜。（从4℃冰箱拿出后室温放置30min后再进行后继实验操作）。
4. 第二天从4℃冰箱拿出湿盒，室温平衡30分钟。
注：使用直标一抗检测时，此步骤结束后即可进行封片。
5. 用1×TBST浸洗3次，每次3 min。切片拍干后在圈内滴加100μl预先稀释好的荧光标记羊抗小鼠/兔IgG（含DAPI 1:10000或Hoechst 33258）覆盖组织，室温孵育1小时。
6. 封片：用1×TBST浸洗3次，每次3 min。清洗完毕后用抗荧光淬灭封片剂封片（封片时组织上不要有气泡，避免影响拍照）。
四、注意事项
1. OCT包埋前须完全除去组织表面的液体，防止冷冻时形成冰晶损伤组织。
2. OCT中不能有气泡，特别是样品附近的气泡会影响冰冻切片效果。
3. 冰冻切片-20℃保存时间约为1个月，如需长期保存请置于-80℃，可保存一年。
五、常见问题与解决方案
1. 卷曲：切片刀温度较高/防卷板安装的位置太过靠前/脑组织未速冻完全，可适当向后调节防卷板位置、提前便安装防卷板和刀片预冷。
2. 褶皱：冰冻箱中操作温度过高，应将适当调低箱体温度。
3. 破碎：防卷板上存在缺口或冰冻箱内温度过低，应及时更换防卷板或适当调高箱体温度。