MycoHUABIO Mycoplasma qPCR Detection Kit
支原体DNA检测试剂盒
(qPCR法)说明书
货号:K0105
█ 产品介绍
MycoHUABIO 支原体DNA qPCR检测试剂盒按照EP2.6.7和JPXVII支原体检测相关标准进行验证,可用于检测主细胞库、工作细胞库、临床治疗用细胞和生物制品中是否存在支原体污染。
本试剂盒利用荧光探针法qPCR技术,参照EP2.6.7和JP XVII支原体检测相关要求进行验证,检测快速,在2h內可完成检测工作,专一性强。
注:本试剂盒仅用于研究,不能用于临床诊断。
█ 灵敏度和特异性
本试剂盒检测了EP2.6.7和JP XVII提到的10种支原体10CFU标准品(MB公司购买)灵敏度,均可达到10CFU/ml,另EP2.6.7和JP XVII中提到的3种支原体相关细菌检测结果均为阴性。符合EP2.6.7和JP XVII的相关灵敏度及特异性要求。
表1. 10种支原体标准品检测结果
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菌株 |
阳性/总数 |
菌株 |
阳性/总数 |
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口腔支原体 |
24/24 |
关节液支原体 |
24/24 |
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鸡毒支原体 |
23/24 |
精氨酸支原体 |
24/24 |
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莱氏无胆甾原体 |
24/24 |
猪鼻支原体 |
24/24 |
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发酵支原体 |
23/24 |
柠檬螺原体 |
24/24 |
|
肺炎支原体 |
24/24 |
唾液支原体 |
24/24 |
结果表明:支原体检测试剂盒检测各支原体标准品10CFU/ml浓度,检出比均大于95%,符合欧洲及日本药典特异性及灵敏度要求。
表2. 三种支原体密切相关细菌检测结果
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细菌名称 |
嗜酸乳杆菌 |
肺炎链球菌 |
丙酮丁醇梭菌 |
|
检测结果 |
阴性 |
阴性 |
阴性 |
结果表明:与支原体密切相关的3种细菌基因组检测结果为阴性,符合欧洲及日本药典特异性要求。
█ 稳定性
MycoHUABIO支原体DNA检测试剂盒经过5次冻融测试,试剂盒性能不受影响。
█ 测试仪器
Roche LightCycler 480 II
█ 产品信息
表3. 产品货号信息
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产品名称 |
产品编号 |
规格 |
|
MycoHUABIO Mycoplasma qPCR Detection Kit MycoHUABIO支原体DNA检测试剂盒 |
K0105-25T |
25T |
|
K0105-100T |
100T |
█ 试剂盒组分
表4. 试剂盒组分
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组分 |
产品编号/规格 |
包装 |
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|
K0105-25T |
K0105-100T |
|||
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K0105-1 |
Buffer |
375 µl |
2x 750 µl |
透明管绿色盖 |
|
K0105-2 |
引物/探针混合物 |
100 µl |
400 µl |
棕色管 |
|
K0105-3 |
内控 |
500 µl |
2 x 1 ml |
透明管蓝色盖 |
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K0105-4 |
阳性模板 |
250 µl |
1 ml |
透明管红色盖 |
|
K0105-5 |
无菌水 |
500 µl |
2 x 1 ml |
透明管 |
█ 储存方法及有效期
-20℃保存,有效期 24个月。
█ 操作方法
1. 配制预混液
将各试剂于冰上融解,Buffer试剂上下颠倒轻轻混匀后轻微离心,其他试剂涡旋混匀后轻微离心。
按照下列组分配制反应预混液:
表5.预混液配制表
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试剂组分 |
单孔用量 |
|
Buffer |
15 µl |
|
引物/探针混合物 |
4 µl |
|
内控 |
1 µl |
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总体积 |
20 µl |
注:实验分为1个阳性组、1个阴性组和N个实验组,每组应设2个重复,根据反应孔数计算所需的预混液总量。若实验组样品在DNA提取时(每个检测样品建议加入20 µl内控)已加入内控,则配制反应预混液时应将内控替换为无菌水;DNA提取时需设置阴性质控样品NCS,即加入同等内控的无菌水,验证提取过程是否异常;提取的洗脱体积建议不超过100 µl,以保证qPCR反应的灵敏度。
2. 分装与加样
2.1轻轻吹打混匀反应预混液,按20 µl每孔分装到qPCR 96孔板中(阴性组排版时最好放在A行,并隔孔再加阳性组或实验组,降低污染的概率);
2.2按照下表分组,将对应的模板加入到反应孔底部(样品间注意更换枪头,避免污染);
2.3将96 孔板用光学膜封板,轻微震荡混匀,快速离心后放入 qPCR 仪(避免徒手触摸光学膜)。
表6.各反应孔加样示例
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阴性组 |
10 µl 无菌水+20µl预混液 |
|
阳性组 |
10 µl 阳性模板+20µl预混液 |
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实验组 |
10 µl 待测样品+20µl预混液 |
3. qPCR程序设置
3.1选择双通道水解探针法程序(FAM为支原体检测通道,HEX为内控检测通道)或根据不同仪器设置双通道检测, FAM为支原体检测通道,HEX为内控检测通道。
3.2设置反应程序:
表7.反应程序
█ qPCR结果分析
不同仪器分析方法不同,分析后先查看下扩增曲线形态是否正常。分析后根据以下表格参考判断实验结果:
表8.结果分析标准
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|
FAM信号 |
HEX信号 |
判定结果 |
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阴性组 |
CT≥40或无“S”型扩增曲线 |
CT<40且有“S”型扩增曲线 |
阴性 |
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阳性组 |
CT<40且有“S”型扩增曲线 |
CT<40且有“S”型扩增曲线 |
阳性 |
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实验组 |
CT≥40或无“S”型扩增曲线 |
CT<40且有“S”型扩增曲线 |
阴性 |
|
CT≥40或无“S”型扩增曲线 |
有抑制 |
||
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CT<40且有“S”型扩增曲线 |
CT<40且有“S”型扩增曲线 |
阳性 |
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CT≥40或无“S”型扩增曲线 |
有抑制 |
注:如HEX信号有抑制,建议对样品进行基因组提取后再检测。
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