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客户文章|CyclinK调节pre-RC组装以促进哺乳动物细胞增殖
发布人: 发布时间: 2018-08-16
   近期,一篇发表在Nature子刊《Nature Communications》上的文章揭示了哺乳动物细胞增殖中细胞周期蛋白K的调控机制,报道了细胞周期蛋白K(Cyclin K)调节复制前体复合物(pre-RC)的形成。
   四川大学生命科学学院的肖智雄教授、朱晓峰教授及李沁桐教授为这篇文章的共同通讯作者。
作者介绍
肖智雄教授
   国家特聘专家,中组部首批千人计划入选者,主要研究方向为:肿瘤分子生物学,信号传递, 细胞生长代谢与衰老,转化医学。
朱晓峰教授
   研究方向主要以生物糖组分、生物卤化物等特殊天然产物的生物合成过程为研究对象,运用X-射线单晶衍射分析对糖基转移酶、卤化酶进行了高分辨率的三维结构解析,并结合其他酶学研究方法,直观反映酶的催化过程,透彻揭示了这些酶的化学反应机理,为酶功能的改造和运用,新型药物的设计开发提供了理论基础。
李沁桐教授
   长期从事干细胞生物学及蛋白激酶的功能调控等方向的研究,在生物化学、分子生物学、细胞生物学和遗传学等多学科交叉融合的领域里逐渐形成了有特色的研究方向。
让我们随小编一起来看下这篇文章介绍的内容吧!
前言介绍:
   精确调节DNA复制对于维持细胞增殖和基因组完整性至关重要。复制前体复合物(pre-RC)仅在G1阶段组装,这一过程称为复制起始执照(replication origin licensing),以确保每个细胞周期的单轮DNA复制。复制前体复合物(pre-RC)通过顺序募集起始识别复合物(ORC1-ORC6),细胞分裂周期蛋白6(CDC6),染色质执照和DNA复制因子1(CDT1),以及由包含微染色体维持蛋白(MCM2-MCM7)的解旋酶复合物来形成。G2 / M和S期阻止复制前体复合物(pre-RC)形成的机制已经很清楚。在生理条件下,有丝分裂激酶的活性通过在G2 / M期促进酶与Geminin蛋白(由GMNN基因编码)的相互作用来稳定CDT1。同时,Geminin通过阻止CDT1加载到DNA上以及与MCM2-MCM7相互作用来限制执照过程。在DNA合成期间,CDT1以PCNA依赖性方式在DNA上快速降解,以确保在S期中不能组装新的复制前体复合物(pre-RC)。 CDC6和起始识别复合物也可以通过各种机制进行调节,以进一步防止pre-RCs不恰当的组装。
   致癌信号可以破坏复制前体复合物(pre-RC)组装的精确调节。早期研究已经证实,即使在高度转化的癌细胞中,细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)过表达对G1期的pre-RC前期形成也是不利的,这被认为会导致执照过程不足,随后遗传不稳定,并最终导致肿瘤发生。最近的全基因组测序研究通过证明Cyclin E1在人类高分化浆液性卵巢癌的大部分中被扩增而强化了这一概念,高分化浆液性卵巢癌是一种基因组不稳定的疾病。另一方面,当细胞从G0阶段(静止)出来进入细胞周期时,Cyclin E1是pre-RC有效组装所必需的。Cyclin E1的这些功能部分独立于其同源激酶CDK2,尽管确切的分子机制仍然未知。总之,这些观察表明Cyclin E1的活性在G1期pre-RC组装过程中需要受到严格调节。
结论
    在G1期间复制前体复合物(pre-RC)的组装必须严格控制以维持细胞增殖及基因组稳定性。G2 / M和S期阻止复制前体复合物(pre-RC)形成的机制已经很清楚,而在G1期间细胞如何确保复制前体复合物(pre-RC)的有效组装则不太清楚。 文章中,作者报道了细胞周期蛋白K(Cyclin K)调节复制前体复合物(pre-RC)的形成。
实验发现,细胞周期蛋白K(Cyclin K)表达与细胞增殖正相关,并且Cyclin K或其同源激酶CDK12的敲低阻止了复制前体复合物(pre-RC)在G1期的组装。 机制在于,Cyclin K通过限制G1期中细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)活性来促进复制前体复合物(pre-RC)的组装。 作者在Cyclin E1中鉴定发现了一个Cyclin K依赖的新磷酸化位点,该位点能破坏其与CDK2的相互作用。 重要的是,这种拮抗关系在细胞周期蛋白E1(Cyclin E1)过表达的肿瘤中被广为概括。 作者根据最近有关细胞周期蛋白K和CDK12与人类肿瘤发生的关联的报道讨论了实验研究结果的意义。
   作者通过一系列实验及数据分析得出了以上结论,实验过程中用到的CDC6 pSer54抗体(ET1612-96)由华安生物提供。
   Fig Uncontrolled CDK2 activity in G1 inhibits pre-RC assembly. a Ectopic expression of cyclin E1 inhibited pre-RC formation in various cell lines. HeLa cells were transfected with vector control (vec.) or cDNA encoding cyclin E1 (Cyclin E1). Cells were synchronized at M phase and released using the same protocol in previous figures. Similar results were obtained in HEK293 (Fig. 5m) and HCT116 cells (b). b CDK2 inhibitor treatment (dinaciclib, 500 nM) eliminated the negative effect of cyclin E1 on pre-RC assembly. HCT116 cells were transduced with vector control (vec.) or cDNA encoding cyclin E1 (Cyclin E1). Cells were synchronized at M phase and released into fresh medium with or without small-molecule CDK2 inhibitor. c CDC6 protein level was reduced in CDK2 knockout HCT116 cell lines. Similar results were obtained in several independent cell lines. Knockout cell lines were generated by CRISPR/Cas9 technology. d Growth curve comparison of wild-type (wt), cyclin E1 knockout (Cyclin E1−/−) and CDK2 knockout (CDK2−/−) HCT116 cell lines. Data are means ± SEM (n = 3) (*p < 0.05; Student’s t-test; CDK2−/− compared to wt). e CDK2 overexpression did not increase CDC6 protein level. Ectopically expressed CDK2 was functional because it restored CDC6 protein level in CDK2 knockout HCT116 cells. f The kinetics of pre-RC assembly was comparable in wild-type and CDK2 knockout HCT116 cells. g CDK2 knockout eliminated the negative effect of cyclin E1 on pre-RC assembly, consistent with CDK2 inhibitor treatment (b). All experiments were repeated at least three times and representative results are shown
小知识:
    细胞周期(cell cycle)是指亲代细胞分裂结束到子细胞分裂结束之间的间隔时期。一个典型的细胞周期由4个期(G1-S-G2-M)构成,并且细胞周期受到胞内外信号传导途径及反馈环路的调控。目前已发现A-J 10种细胞周期蛋白(cyclins)作用于细胞周期,有些含亚型如cyclin D1、cyclin D2等。细胞周期调控机制紊乱是细胞增生失控从而导致癌变的重要原因,细胞周期蛋白(cyclins)在其中发挥重要作用。
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